骨關(guān)節(jié)炎( OA) 屬于中醫(yī)學(xué)痹證的范疇，好發(fā)于 老年人，以軟骨退變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生、細(xì)胞外基 質(zhì)( ECM) 代謝失調(diào)為主要的病理特征，軟骨變性是 OA 的最基本病理改變，臨床上表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的疼痛、 僵硬、肥大及功能活動(dòng)受限等 。臨床上應(yīng)用補(bǔ)腎 益肝活血方治療 OA 療效顯著，取得良好臨床效果， 并通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討了該方對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡、骨髓基質(zhì) 細(xì)胞( BMSCs) 分化的影響，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益肝活血方有 抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用，其含藥血清能有效誘導(dǎo) BMSCs 成軟骨細(xì)胞分化，其作用機(jī)制很可能與細(xì)胞 外信號(hào)調(diào)節(jié)激 酶 ( EＲK) 和絲裂原活化蛋白激酶( MAPKs) 存在相關(guān)聯(lián)系。本研究旨在分析補(bǔ)腎益 肝活血方對(duì) OA EＲK/p38MAPKs 信號(hào)通路產(chǎn)生的 影響，探究 OA 發(fā)生機(jī)制及 OA 治療中的機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料

1. 1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康的、成年 SPF 級(jí)雌性 SD 大鼠，重量 185 ～ 230 g，實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物全部由南京 中醫(yī)藥大學(xué)研究所提供。為了使這些大鼠適應(yīng)周圍 環(huán)境，納入本實(shí)驗(yàn)的所有 SD 大鼠均于實(shí)驗(yàn)前 1 w 放 置在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，飼養(yǎng)員進(jìn)行常規(guī)的分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn) 室基本指標(biāo): 保持自然光照，良好的通風(fēng)，室內(nèi)溫度 要求控制在 18. 5～23. 0℃，濕度控制在 40% ～ 70%。 實(shí)驗(yàn)研究期間，所有大鼠進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒詞料，并可以 自由地飲用自來(lái)水，術(shù)前 8 h 禁食水。

1. 1. 2 主要試劑、儀器與藥品

胎牛血清( FBS，Gibco 公司) ; DMEM 低糖培養(yǎng)基( Hyclone 公司) ; 雙抗混合液( 100 U/ml 青霉素、100 μg /ml 鏈霉素) ，10%胰 蛋白酶、0. 2%Ⅱ型膠原酶( Sigma 公司) ; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 ( Fermentas 公司) ; 引物合成( 上海生工生物工程公司) ; 磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶 p38 抗體( Anti-pp38α，Thr180/Tyr182) 一抗( Millipore 公司) ; p38 一抗 ( Millipore 公司) 。二氧化碳培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微 鏡、流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀、濾器、無(wú)菌操作臺(tái)和掌上迷你離心機(jī)。補(bǔ)腎益肝活血方由骨碎補(bǔ) 15 g、丹參10 g、沒(méi) 藥 10 g 及懷牛膝 10 g 組成，實(shí)驗(yàn)所用藥物由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬省中西結(jié)合醫(yī)院藥劑科提供。

1. 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

40 只雌性 SD 大鼠隨機(jī)分為 4 組，即對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每 組各 10 只。

1. 3 補(bǔ)腎益肝活血方含藥血清的制備

根據(jù)人和 動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比率表?yè)Q算，給 藥組給予補(bǔ)腎益肝活血方 3. 2 g /( kg·d) 灌胃，對(duì) 照組則給予等量的生理鹽水灌胃。各組每 12 h 灌 胃給藥 1 次，連續(xù)灌胃 5 d。并在最后一次灌胃前禁 食，末次灌藥 3 h 后，麻醉 SD 大鼠，行腹主動(dòng)脈采 血，靜置于溫度預(yù)調(diào)在 4℃ 的冰箱 4 h 后，離心機(jī)設(shè) 置 2 500 r/min 的轉(zhuǎn)速，離心 25 min，分離離心所得 血清，將同組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分離所得到的血清予以混合， 并在 56℃ 水浴箱內(nèi)，滅活 30 min，抽濾、除菌后分 裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?br />
2 結(jié) 果

體外分離培 養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞外觀近似圓球的形狀，呈懸浮狀 態(tài)，折光性較好，在接種后的 12 h 左右，開(kāi)始貼壁生 長(zhǎng)，當(dāng)軟骨細(xì)胞在壁上生長(zhǎng) 24 ～ 48 h，大部分軟骨 細(xì)胞貼壁伸展，形狀多呈現(xiàn)出三角形、扁平形及多角 形，部分細(xì)胞出現(xiàn)分裂相。甲苯胺藍(lán)染色后可見(jiàn) 細(xì)胞核呈深藍(lán)色，有 1～2 個(gè)核仁，胞質(zhì)呈淡藍(lán)色，細(xì) 胞外基質(zhì)著淺藍(lán)色。軟骨細(xì)胞的胞質(zhì)經(jīng)異 硫氰酸熒光素( FITC) 染色后發(fā)出鮮亮的綠色熒光， 呈強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞核區(qū)域沒(méi)有著色。細(xì)胞核經(jīng) 4＇，6-二 脒基-2-苯基吲哚( DAPI) 染色后激發(fā)出藍(lán)色熒光。幾乎全部細(xì)胞表達(dá)了Ⅱ型膠原， 進(jìn)一步證明本實(shí)驗(yàn)得到了純度很高的軟骨細(xì)胞。

3 討 論

OA 是一種退行性變的疾病，好發(fā)于老年人，據(jù) 統(tǒng)計(jì)，我 國(guó) 40 歲以上人群原發(fā)性 OA 患 病 率 為 46. 3% 。OA 的特征性改變是軟骨的退變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)的增生，實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)為進(jìn)行性的關(guān)節(jié)軟骨 破壞和骨贅的形成，軟骨變性是 OA 的最基本病理 改變 。OA 可同時(shí)伴有不同程度的滑膜炎癥，最 終可以出現(xiàn)關(guān)節(jié)的疼痛、僵硬、肥大及功能活動(dòng)等受到限制 。關(guān)節(jié)軟骨的退變與破壞是 OA 最主要 的病理環(huán)節(jié)，軟骨組織內(nèi)只有一種細(xì)胞成分，就是軟 骨細(xì)胞，而軟骨細(xì)胞在體內(nèi)不增殖 。為了本研 究的進(jìn)一步進(jìn)行，本研究采用體外實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法， 用 SD 雌性大鼠肋骨的軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)。