鄰苯二甲酸二( 2-乙基) 己酯( di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP) 又名鄰苯二甲酸二異辛酯，屬于 鄰苯二甲酸酯類(lèi)( phthalate acid esters，PAEs) 化合 物，是目前使用最廣泛的 PAEs 增塑劑。鄰苯二甲酸 單 ( 2-乙 基 己 基 ) 酯 ( mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP) 是 DEHP 在哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的 主要活性代謝產(chǎn)物。PAEs 塑化劑 DEHP 暴露 所致健康損害已成為我國(guó)當(dāng)前重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。研究顯示，DEHP 及其代謝產(chǎn)物 MEHP 具有 生 殖 發(fā) 育 毒 性，是 一 類(lèi) 環(huán) 境 內(nèi) 分 泌 干 擾 物，但其具體毒作用機(jī)制尚未完全闡明。

1 材料與方法

1． 1 細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，為小鼠睪 丸間質(zhì)瘤細(xì)胞( MA-10 mouse leydig tumor cells， mLTC-1 ) 。用含 10% FBS 的 1640 培養(yǎng)液體外培 養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。設(shè) DMSO 溶 媒對(duì)照組 ( 0μmol /L) 、MEHP 處理組 ( 200、400、 800μmol /L) ，作用 24h，加 hCG 0． 1U/mL 作用 4h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液用于檢測(cè)孕酮; 提取細(xì)胞總 ＲNA 用于檢測(cè)類(lèi)固醇激素合成關(guān)鍵酶 ( StAＲ/ P450scc /3βHSD) 及 MEF2A 的表達(dá)等。

1． 2 主要試劑與儀器

胎牛血清 FBS( Gibco) ，1640 細(xì)胞培養(yǎng)液( hyclone) 、青霉素-鏈霉素溶液( 碧云天) 、PBS ( hyclone) 、DMSO( 國(guó)產(chǎn)) 、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( TAKAＲA) 、 TＲizol( Invitrogen) 、分子生物學(xué)級(jí)超純水( 杭州吉 諾) 、胰酶細(xì)胞消化液( 碧云天) ，MEHP ( 純度為 97%，Sigma) ，人絨毛膜促性腺激素( 國(guó)產(chǎn)) 、孕酮 ELISA 試劑盒( 上海易利) 。引物由上海生工合成。ABI step one plus 實(shí)時(shí)熒光定量 PCＲ 儀( ABI 公司) 、核酸定量?jī)x( Eppendorf 公司) 、全波長(zhǎng)酶 標(biāo)儀( Thermo ) 、臺(tái) 式 高 速 冷 凍 離 心 機(jī) ( Eppendorf) 、CO2 培養(yǎng)箱( Galaxy170S) 、倒置相差顯微鏡 ( 奧特光學(xué)) 、PCＲ 板離心機(jī) ( BE-6100，其林貝爾) 、可調(diào)式漩渦混勻儀( 賽洛捷克) 、掌上離心機(jī) ( 賽洛捷克) 。

1． 3 CCK8 比色法檢測(cè)

MEHP 對(duì) mLTC-1 細(xì)胞增殖活力的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，加入 96 孔板，每孔加入100 μL，細(xì)胞密度為1 ×103 /孔，其 中邊緣孔加入無(wú)菌培養(yǎng)液。細(xì)胞貼壁后更換為無(wú) 血清培養(yǎng)基，孵育 12h 使細(xì)胞同步化。隨后加入 不同濃度 MEHP，對(duì)照組細(xì)胞中加入含 DMSO 的 新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24h，各孔加入 10μL 濃度為 CCK8 試劑，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)為 450 nm 的光 密度值( OD450) 。每個(gè)濃度重復(fù) 6 個(gè)孔。

1． 4 ELISA 法檢測(cè)

MEHP 對(duì)孕酮含量的影響 收集細(xì)胞培養(yǎng)液，按試劑盒操作說(shuō)明測(cè)量孕 酮含量。在 450nm 檢測(cè) OD 值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算出各組的孕酮濃度。

1． 5 qＲT-PCＲ 檢測(cè)

StAＲ/P450scc /3βHSD、 MEF2A mＲNA 的表達(dá) 應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)上述基因引物( 如表 1) ，BLAST 驗(yàn)證其有效性，送至生物公司合成，將 提取的細(xì)胞 ＲNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，qＲT-PCＲ 檢測(cè) 各組基因表達(dá)量。

1． 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 20． 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Prism 6． 0 軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。多組間均數(shù)比較采用 ANOVA， 兩兩比較用 Tukey 法，P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

2 結(jié) 果

不同濃度 MEHP 染毒 mLTC-1 細(xì)胞 24h，結(jié)果 顯示各組細(xì)胞 OD 值與對(duì)照組比較沒(méi)有差異，表 明實(shí)驗(yàn)所用 MEHP 濃度不影響細(xì)胞增殖活力，有 利于開(kāi)展相關(guān)的功能研究。MEHP 作 用 24h 后，細(xì) 胞 培 養(yǎng) 液 中 孕 酮 ( PＲOG) 隨 染 毒 劑 量 增 高 呈 下 降 趨 勢(shì)，其 中 800μmol /L 組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 01) 。隨著 MEHP 染毒劑量的增高，StAＲ mＲNA 逐 漸降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 01，圖 3A) 。P450scc mＲNA 和 3βHSD mＲNA 表 達(dá) 水 平 在 400μmol /L 和 800μmol /L 組 與 0μmol /L 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) 。

3 討 論

PAEs 是一類(lèi)大量應(yīng)用于 PVC 塑料工業(yè)的塑化 劑，用以增加材料的柔韌性和可塑性。含 PAEs 的 塑料制品在生產(chǎn)和生活中廣泛應(yīng)用，如兒童玩具、食品包裝材料、醫(yī)用血袋和膠管、地板、壁紙、清潔 劑、潤(rùn)滑油、個(gè)人護(hù)理用品( 如指甲油、頭發(fā)噴霧劑、 香皂和洗發(fā)液) 等產(chǎn)品均含有 PAEs，人體暴露機(jī)會(huì) 極高。目前的動(dòng)物體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究顯示，PAEs 是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，DEHP 及其代謝產(chǎn)物 MEHP具有生殖發(fā)育毒性、胚胎毒性、免疫毒性、肝腎毒性 及神經(jīng)毒性等多種毒性。其中生殖發(fā)育毒性研究的 最多，睪丸是 DEHP 及 MEHP 的主要靶器官。Leydig 細(xì)胞是睪丸內(nèi)主要的內(nèi)分泌細(xì)胞，其合成分泌的睪 酮對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育非常重要。孕酮是睪酮 合成中非常重要的前體物，其分泌量與睪酮存在密 切的正相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MEHP 暴露 24h 后在 200μmol/L 對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞孕酮分泌影響較小，400μmol/L 以上尤其是800μmol/L 有較明顯的抑制孕酮分泌的 作用，與多數(shù)研究結(jié)果一致，驗(yàn)證了 MEHP 高劑量暴 露抑制雄性甾體激素分泌的觀點(diǎn)。



 

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