胃癌的發(fā)病率、死亡率在所有惡性腫瘤中位居前列,由于缺乏早期診斷手段,超過(guò) 70%的患者確診 時(shí)已有轉(zhuǎn)移或進(jìn)入中晚期。曲妥珠單抗為靶向 HER-2 的單克隆抗體藥物,通過(guò)拮抗 HER-2 信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)及抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用發(fā)揮作用,用于 HER-2 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌和胃癌的治療。盡 管曲妥珠單抗療效確切,然而腫瘤獲得性耐藥已成為影響其有效治療的重要問(wèn)題。因此,研究胃癌 曲妥珠單抗耐藥機(jī)制,對(duì)闡明逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)理,增強(qiáng)腫瘤化療敏感性具有重要意義。
Q-Exactive Plus 質(zhì)譜儀和 Easy-nLC 1000 nano 液相色譜儀( 美國(guó) Thermo Fisher 公司) ; VCX500 型 SONICS 多功能超聲儀( 美國(guó) Sonics 公司) ; HS-3 垂直混合儀( 寧波新芝生物公司) ; GL-802B 微型真空 泵( 海門(mén)其林貝爾儀器公司) ; 5810R 型真空濃縮儀( 德國(guó) Eppendorf 公司) ; DYY-6C 型電泳儀( 北京六 一儀器公司) ; CKX31 型光學(xué)顯微鏡( 日本 Olympus 公司) ; LRH-70 生化培養(yǎng)箱( 上海一恒科學(xué)儀器 公司) 。 NCI N87 和 NCI N87 /R 細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院施明教授惠贈(zèng)。注射用曲妥珠單抗( 上海羅氏制藥 有限公司,規(guī)格 440 mg,批號(hào) S20060026) ; 胎牛血清( FBS,美國(guó) Gibco 公司) ; DMEM 培養(yǎng)基和胰酶( 美 國(guó) Mediatech 公司) ; 雙抗( 含 100 μg /mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素,北京鈕英泰克生物技術(shù)有限公 司) ; pGEX4T2-catTFRE 重組質(zhì)粒( 上海 Sigma 公司合成) ; Biotin 標(biāo)記的 catTFRE 引物( 華大基因合成, 引 物 5' 用 biotin 標(biāo) 記, 正 向 引 物: 5'-CCCAGTCACGTAGCGATAGC-3', 反 向 引 物: 3'-CGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAG-5') ; DNA 聚 合 酶、DNA Ladder、DL2000 DNA ladder ( 日 本 TakaRa 公司) ; Pure Plasmid Mini Kit、Gel extraction kit、Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒( 北京康為世紀(jì)生 物有限公司) ; NE-PER 核蛋白提取試劑盒、DynabeadsTM M-280 Streptavidin 親和磁珠( 美國(guó) Thermo Fisher 公司) ; 胰酶( 美國(guó) Promega 公司) ; 抗體 c-Jun( 9165) 、JunB ( 3753) 、c-Myc ( 5605) 和 GAPDH ( 5174) ( 美國(guó) Cell Signaling Technology 公司) ; NaHCO3、NaOH( 分析純,美國(guó) Sigma 公司) ; 甲醇、乙醇、 乙腈、甲酸、純水( HPLC 級(jí),美國(guó) Thermo Fisher 公司) ; NETN、BC-0、2 ×DNA Binding Buffer、1 ×DNA Binding Buffer、BC-150、BC-200、50×TAE 和 Destain 脫色液(自制) 。
親代細(xì)胞 NCI N87 和耐藥細(xì)胞 NCI N87 /R 采用 DMEM ( 加 10% FBS 和 1%雙抗) 培 養(yǎng)基,在 5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞傳代 2~3 次后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為保持耐藥性質(zhì),NCI N87 /R 細(xì)胞 培養(yǎng)過(guò)程需加入一定量的曲妥珠單抗,終濃度為 40 μg /mL。
pGEX4T2-catTFRE 的提取 catTFRE 序列根據(jù)高等脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子庫(kù)設(shè)計(jì) ( http: / /jaspar.genereg.net /) ,將其鏈接到 pGEX4T2 載體上,得到全長(zhǎng)為 2.8 kb 的重組質(zhì)粒。將 1 μL pGEX4T2-catTFRE 質(zhì)粒加入到 50 μL TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)熱激、復(fù)蘇后涂布于氨芐抗性 LuriaBertani 平板,37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜,取單菌落接種于 2 mL Luria-Bertani 培養(yǎng)液,培養(yǎng) 6 h,按 1 ∶ 100 接種至 50 mL 培養(yǎng)基,培養(yǎng) 18 h,按試劑盒說(shuō)明提取質(zhì)粒。
2.2.3 Biotin 標(biāo)記
catTFRE DNA 擴(kuò)增 引物序列見(jiàn) 2.1 節(jié),PCR 反應(yīng)體系及條件詳見(jiàn)文獻(xiàn)。DNA 序列見(jiàn)電子版文后支持信息。
catTFRE DNA 的純化與回收 catTFRE DNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,切下目的條帶, 使用 DNA 凝膠試劑盒回收、純化,測(cè)定濃度后分裝,!20℃保存,備用。
收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞,用預(yù)冷 PBS 清洗 2 次,重懸,800 r/min 離心 5 min,棄 上清液。利用 NE-PER 試劑盒提取核蛋白,加入 CERI 和蛋白酶抑制劑,振蕩,冰上裂解 15 min。加入 適量 CERII,振蕩 10 s,冰上裂解 30 s,4℃、16000 r/min 離心 5 min,棄去上清液,沉淀加入 NER 重懸,振 蕩 20 s,4℃ 垂直混勻儀孵育 1 h。4℃、16000 r/min 離心 20 min,將核蛋白提取物轉(zhuǎn)移于 EP 管中,用 Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。
pull down 取 DynabeadsTM M-280 Streptavidin 適量于 EP 管中,加入 300 μL1 × DNA 結(jié)合緩沖液清洗 M-280,加入計(jì)算量的 catTFRE DNA( 120 μL M-280 結(jié)合 3 pmol /LcatTFRE DNA) , 再加入等量 2×DNA 結(jié)合緩沖液,4℃垂直混勻儀孵育 20 min。用 200 μL BC-200 清洗 M-280,加入核蛋白, 用 BC-0 調(diào)整鹽濃度至 200 mmol /L,4℃孵育 2 h,分別用 50 mmol /L NETN 和 PBS 清洗 M-280。
樣品中加入 20 μL 上樣緩沖液,混勻,95℃ 金屬浴煮 5 min,取上清液,進(jìn) 行 SDS-PAGE 電泳,待 Marker 進(jìn)入分離膠約 2.0 cm 停止電泳,用考馬斯亮藍(lán)染色。將膠條自下而上 橫切成 6 等份,分別置于 EP 管中,加入 500 μL Destain 脫色液,振蕩至完全脫色,加入 200 μL 75%乙 腈,振蕩 30 min,吸去脫色液; 加入質(zhì)譜水 500 μL,振蕩水化 1 h,加入 50 mmol /L NH4HCO3 300 μL,振 蕩 5 min,吸去上清液,加入 100 ng /μL 胰酶-50 mmol /L NH4HCO3( 1∶ 10,V /V) 溶液,搗碎膠條,37℃孵育 過(guò)夜,肽段消化后用 200 μL 乙腈萃取 2 次,合并萃取液,12000 r/min 離心 5 min,加入 30 μL 0.1%甲酸, 振蕩 5 min,再加入 200 μL 乙腈,振蕩 5 min,合并上清液,60℃真空抽干,質(zhì)譜檢測(cè)。
3 結(jié)果與討論
參照文獻(xiàn)進(jìn)行重組質(zhì)粒 pGEX4T2-catTFRE DNA 提取與純化。結(jié)果顯示,在 2.8 kb 位置可見(jiàn)清 晰且無(wú) 干 擾 的 目 的 條 帶 ( 圖 1) ,與 DL2000 DNA marker 相比,提取質(zhì)粒濃度≥100 ng /μL,濃度及純 度均符合實(shí)驗(yàn)要求。為檢測(cè)和定量分析曲妥珠單抗耐藥胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn) 錄因子,分別提取 NCI N87 和 NCI N87 /R 細(xì)胞核蛋 白,利用液相色譜-質(zhì)譜結(jié)合 catTFRE pull down 的蛋 白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行檢測(cè)和定量分析,采用生物信息學(xué)技術(shù)分析與 DNA 的結(jié)合活性顯著變化 的轉(zhuǎn)錄因子。
從肽段水平設(shè)置 1% FDR,共鑒定得到轉(zhuǎn)錄因子 359 個(gè)。為明確數(shù)據(jù)分布,對(duì) NCI N87 /R 和 NCI N87 樣本的所有蛋白質(zhì)的變化倍數(shù)( Fold change) 進(jìn)行總體分析,以 NCI N87 /R 與 NCI N87 3 次生物學(xué) 重復(fù)樣本中蛋白質(zhì)峰面積均值之比作為變化倍數(shù),再進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn) 90%以上的蛋白質(zhì)在 NCI N87 /R/NCI N87 中的變化倍數(shù)介于 1.5 倍范圍內(nèi),不足 10%的蛋白質(zhì)豐度變化較大( 這些蛋白質(zhì)具有較 小的 iFOT ( iFOT<1) ) ,總體數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布( 圖 4A) 。因此,兩組樣本的均值滿(mǎn)足獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)分 析。根據(jù)顯著性水平及均值的變化倍數(shù)繪制餅圖,若某轉(zhuǎn)錄因子在 3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值在兩組樣本中 的比值大于 1.5,即轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 結(jié)合活性或其表達(dá)量變化≥1.5 倍( Fold change≥1.5) 且p<0.05,則 認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄因子在耐藥細(xì)胞中被激活,其中 Fold change( NCI N87 /R/NCI N87) ≥1.5 且p<0.05表示轉(zhuǎn)錄 因子與 DNA 的結(jié)合活性增強(qiáng)或表達(dá)量增加; Fold change( NCI N87 /R/NCI N87) ≤0.67 且p<0.05表示與 DNA 的結(jié)合活性減弱或表達(dá)量降低。
本研究基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜結(jié)合 catTFRE pull down 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),檢測(cè)并定量分析了 NCI N87 和 NCI N87 /R 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子,從轉(zhuǎn)錄調(diào)控角度分析了轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng) NCI N87 細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗 耐藥的可能機(jī)制,并通過(guò)生物信息學(xué)手段分析了激活轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的信號(hào)通路,構(gòu)建了其調(diào)控關(guān)系,探 究了轉(zhuǎn)錄因子-靶基因的調(diào)控作用,闡釋了 EMT、Wnt、MAPK、凋亡等通路激活貢獻(xiàn)胃癌細(xì)胞對(duì)曲妥珠單 抗的耐藥性,分析了調(diào)控 EMT、Wnt 和 MAPK 通路的多個(gè)靶基因。本研究為胃癌曲妥珠單抗耐藥機(jī)制 研究提供了依據(jù),也為逆轉(zhuǎn)其耐藥治療提供了參考。