維生素是維持人和動(dòng)物正常生理功能不可或缺 的一類(lèi)微量有機(jī)物質(zhì)，在人體生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育過(guò)程 中發(fā)揮著重要作用。人體必需維生素可分為兩類(lèi)：水溶性維生素和脂溶性維生素，其中水溶性維生 素中又以 Ｂ 族維生素最為重要，Ｂ 族維生素主 要包括硫胺素（ＶＢ1）、核黃素（ＶＢ2）、煙酰胺、煙酸ＶＢ3）、泛酸（ＶＢ5）、吡哆素（ＶＢ6）、生物素（ＶＢ7）、 葉酸（ＶＢ9）和鈷胺素（ＶＢ12）等。蛋白胨是一種 利用蛋白質(zhì)酶解得到的水溶性混合物。作為微生物 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分，蛋白胨可以提供大部分微生物 生長(zhǎng)、發(fā)育、繁衍所需要的營(yíng)養(yǎng)氮源。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Ｕｌｔｉｍａｔｅ 3000 超高效液相色譜儀、ＴＳＱ Ｅｎｄｕｒａ 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó) Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ 公司）；旋渦混合器VORTEX-5（海門(mén)市其林貝爾）；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 萬(wàn)分之一電 子天平（北京賽多利斯公司）。 甲醇、甲酸銨均為色譜純（德國(guó) ＣＮＷ 公司）；甲 酸為色譜純（天津市福晨化學(xué)試劑廠）。維生素 Ｂ2 （純度 98. 2％）、維生素 Ｂ6（純度 100. 0％）、維生素 Ｂ12（純度 90. 5％）、煙酸（純度 99. 8％）、煙酰胺（純 度 99. 9％）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；維生 素 Ｂ1（純度 95. 2％）、泛酸（純度 96. 5％）、葉酸（純度 91. 3％）、生 物 素 （純 度 99. 0％）均 購(gòu) 自 德 國(guó) Ｄｒ． Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ公司。實(shí)驗(yàn)用水由 Ｍｉｌｌｉ－Ｑ 系統(tǒng)（美國(guó) Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 公司）制得。 準(zhǔn)確稱(chēng)取適量標(biāo)準(zhǔn)品，維生素 Ｂ1、維生素 Ｂ2 和 生物素用甲酸溶解后用甲醇定容，其他標(biāo)準(zhǔn)品均用 甲醇溶解并定容，均置于 100 ｍＬ 棕色容量瓶中，配 制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成 質(zhì)量濃度為 50 ｍｇ ／ Ｌ 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于－18 ℃ 避光保存。根據(jù)需要用水逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥蛇m當(dāng)質(zhì) 量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1．2 樣品前處理

稱(chēng)取 0. 2 ｇ（精確至 0. 000 1 ｇ）樣品，置于 50ｍＬ 離心管中，加入 10 ｍＬ 水，振蕩提取 10 ｍｉｎ，經(jīng) 0. 22 μｍ 濾膜過(guò)濾后，供超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜 儀分析。以上操作均避光進(jìn)行。

1．3 液相色譜與質(zhì)譜條件

1．3．1 色譜條件

色譜柱：Ｓｙｎｃｒｏｎｉｓ Ｃ18 色譜柱（100 ｍｍ × 2. 1 ｍｍ，1. 7 μｍ，美國(guó) Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ 公司）；柱溫：25 ℃；樣品室溫度：10 ℃；流速：0. 30 ｍＬ ／ ｍｉｎ；流動(dòng)相 Ａ：0. 1％ （ｖ ／ ｖ）甲酸水溶液；流動(dòng)相 Ｂ：0. 1％ （ｖ ／ ｖ） 甲酸甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～2. 0 ｍｉｎ，90％ Ａ； 2. 0～3. 0 ｍｉｎ，90％ Ａ～ 45％ Ａ；3. 0 ～ 3. 5 ｍｉｎ，45％ Ａ～10％ Ａ；3. 5～4. 0 ｍｉｎ，10％ Ａ～ 90％ Ａ；4. 0 ～ 8. 0 ｍｉｎ，90％ Ａ。進(jìn)樣量：2 μＬ。

1．3．2 質(zhì)譜條件

離子源：ＥＳＩ 源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方 式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（ＭＲＭ）模式；離子源溫度：370 ℃； 離子傳輸管溫度：370 ℃；離子噴霧電壓：4 000 Ｖ； 鞘氣流速：1. 7 Ｌ ／ ｍｉｎ；輔助氣流速：0. 7 Ｌ ／ ｍｉｎ；碰撞 氣：氬氣。ＭＲＭ 監(jiān)測(cè)離子對(duì)、化合物保留時(shí)間和碰 撞能量（ＣＥ）等參數(shù)見(jiàn)表 1。


2 結(jié)果與討論

質(zhì)譜應(yīng)用技術(shù)中，流動(dòng)相的選擇除考慮色譜的分離效果外還要考慮化合物的離子化程度，由于本 實(shí)驗(yàn)選用電噴霧電離源、正離子模式，所以在流動(dòng)相 中添加了甲酸。此外，有機(jī)相分別采用甲醇和乙腈 進(jìn)行優(yōu)化，分析各種維生素的響應(yīng)強(qiáng)度，最終采用甲 醇作為流動(dòng)相中的有機(jī)相。為了確定本實(shí)驗(yàn)的 ＭＲＭ 條件，依次將單一標(biāo) 準(zhǔn)品溶液（1. 0 ｍｇ ／ Ｌ）不經(jīng)過(guò)色譜柱直接泵入質(zhì)譜 中，在 ＥＳＩ－ 模式下，大部分維生素響應(yīng)較低；在 ＥＳＩ＋ 模式下，9 種 Ｂ 族維生素均能獲得豐度較高的母離 子，其中鹽酸鹽、鈣鹽等都會(huì)脫去鹽后以單一分子的 狀態(tài)離子化，得到［Ｍ＋Ｈ］＋ 峰，維生素 Ｂ12則為多電 子物質(zhì)，滿(mǎn)足［Ｍ＋Ｈ］＋ ／ ｎ 規(guī)律。確定母離子后，分 別對(duì)其子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選擇豐度較高、干 擾較小的兩對(duì)子離子作為定性離子，豐度最高的離 子作為定量離子，然后優(yōu)化其碰撞能量。用 0. 1％ （ｖ ／ ｖ）甲酸水溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各 Ｂ 族維生素的峰面積為縱坐標(biāo)（ｙ）、質(zhì)量濃度為橫 坐標(biāo)（ｘ，μｇ ／ Ｌ）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，9 種維 生素均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（Ｒ2 ）均大于 0. 999。以信噪比為 3 和 10 時(shí)的進(jìn)樣濃度為最低檢 出含量和最低定量含量，根據(jù)樣品前處理過(guò)程，最終 計(jì)算得出該方法的檢出限為 0. 09～1. 67 μｇ ／ Ｌ。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定蛋白胨中 9 種 Ｂ 族維 生素的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)比 Ｂ 族維生 素測(cè)定的相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，本方法不需要使用繁瑣的 微生物法或是高效液相色譜－熒光／ 紫外檢測(cè)法，簡(jiǎn) 化了前處理步驟，降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效 率。該法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，所 建立方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度與重復(fù)性，可為 蛋白胨中 Ｂ 族維生素種類(lèi)和含量的測(cè)定提供技術(shù) 支持，并為蛋白胨質(zhì)量提高及標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供參考。