急性呼吸道感染是小兒時期的常見疾病,臨 床數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示95%以上的小兒急性呼吸道感 染是由病毒導(dǎo)致的,而呼吸道合胞病毒(RSV)就是 引發(fā)急性呼吸道感染的常見病毒之一。RSV感染 主要是由于眼、口、鼻等部位的黏膜接觸導(dǎo)致的, 其中嬰幼兒感染率更高。隨著病情的發(fā)展,小 兒RSV感染除了上呼吸道感染,還可能導(dǎo)致肺炎、 支氣管炎等下呼吸道感染。不同種類病原體的 呼吸道感染的治療方法不同,有效的病原體檢測 分類能為臨床的準(zhǔn)確治療提供參考依據(jù)。病毒 分離培養(yǎng)是檢測RSV感染的金標(biāo)準(zhǔn),但是操作繁 瑣耗時,需要10 d左右才能得到檢測結(jié)果,且檢測 費用高,臨床應(yīng)用受限。
1 對象與方法
1.1 一般資料
選取2017年1月至2019年1月我 院兒科收治的175例呼吸道感染患 兒作為 研究 對象,其中男103例,女72例,年齡0.3~10歲,平均 年 齡 (4.7 ±1.3)歲 ,病 程 4 d ~2 個 月 ,平 均 病 程 (1.3±0.4)個月,其中急性支氣管肺炎67例,毛細(xì) 支氣管炎71例,小兒哮喘37例。
1.2 方法
采用痰液收集器收集所有患兒的鼻 咽吸出物,存貯于儲液器內(nèi),使用Hank液進(jìn)行吹 打混勻后,以1 000 r/min的速度離心5 min,吸取上 清液,并保存在-80 ℃環(huán)境下備用待檢。所有受 檢的患兒均分別采用免疫熒光技術(shù)和熒光探針 PCR技術(shù)檢測患兒RSV感染的情況,并以病毒培養(yǎng) 法進(jìn)行明確診斷。
1.2.1 免疫熒光技術(shù)檢測
吸取500 μL的鼻咽 吸出物樣本,加入5~8 mL的磷酸緩沖鹽溶液, 先置入旋渦混合器(旋渦混合器VORTEX-5)震蕩3~5 min進(jìn)行混合均勻, 再以300~500 r/min的離心速度離心10 min。去除 上清液后,收集下面的沉淀物再次加入5~8 mL 的磷酸緩沖鹽溶液并重復(fù)震蕩和離心的操作。再 次收集沉淀物后加入一定的磷酸緩沖鹽溶液調(diào)成 1.0×106 的細(xì)胞懸液。吸收25 μL的細(xì)胞懸液加入8孔載玻片中,37 ℃條件下待其干燥后使用冷丙 酮固定10 min。接著在玻片上滴加熒光抗體染色, 室溫下進(jìn)行孵育0.5 h。然后采用磷酸鹽吐溫緩沖 液連續(xù)沖洗3次玻片后再采用蒸餾水進(jìn)行沖洗,去 除多余的沖洗液,最后待玻片徹底干燥后在每個 細(xì)胞點上加上1滴封片劑進(jìn)行封片。在德國蔡司公 司的AXIOVERT 40型熒光顯微鏡下觀察載玻片上 細(xì)胞點內(nèi)的熒光情況。以出現(xiàn)熒光蘋果綠視為 PSV感染陽性,否則視為陰性。
1. 2. 2 免 疫 探 針 PCR 技 術(shù) 檢 測
吸 取 150 μL 的 鼻 咽 吸 出 物 樣 本 ,選 用 德 國 Qiagen 公 司 的 QIAmpRNA Mini Kit病毒RNA提取試劑盒按照其 說明書進(jìn)行提取樣本中的病毒RNA。根據(jù)探針設(shè) 計原則選擇的引物為,上游:RSV- F:5'- GGA CAA GTT G TT GAG GTT TAT GAA TAT GC- 3',下游: RSV- R:5'- T TC TGC TGT CAA GTC TAG TACACT GTA GT- 3'。采用隨機(jī)合成的引物將提取到的RNA 合成cDNA,選用美國ABI公司的7500型熒光PCR 儀放入反應(yīng)管進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),設(shè)置的反應(yīng)條 件為:①42 ℃,8 min預(yù)變性。②94 ℃,30 s,55 ℃, 30 s,72 ℃,45 s,35個循環(huán)。熒光素設(shè)定FAM,反 應(yīng)結(jié)束后通過擴(kuò)增Ct值判斷結(jié)果。
1.3 觀察指標(biāo)
統(tǒng)計免疫熒光技術(shù)和熒光探針 PCR技術(shù)進(jìn)行檢測患兒RSV感染的情況,以病毒培 養(yǎng)法的RSV感染結(jié)果作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn),比較免 疫熒光技術(shù)和熒光探針PCR技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染的靈敏度、特異度以及準(zhǔn)確性等診斷效 能。靈敏度=真陽性人數(shù)/(真陽性人數(shù)+假陰性 人數(shù))×100%。特異度=真陰性人數(shù)/ (真陰性人 數(shù)+假陽性人數(shù)) ×100%。準(zhǔn)確性=(真陰性人 數(shù)+真陽性人數(shù))/(真陰性人數(shù)+假陰性人數(shù)+真 陽性人數(shù)+假陽性人數(shù))×100%。
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理
應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn) 行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析,診斷效能等計數(shù)資料采用 率表示,組間差異采用卡方檢驗,P<0.05為差異 有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 兩種檢測方法診斷RSV感染的結(jié)果比較
(表1) 175例呼吸道感染患兒中RSV感染陽性103例,其 中男64例,占比62.14%,女39例,占比37.86%。免 疫熒光技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染陽性98例,其 中真陽性88例,熒光探針PCR技術(shù)檢測診斷患兒 RSV感染陽性104例,其中真陽性102例。
2.2 兩種檢測方法診斷RSV感染的診斷效能比較
(表2) 免疫熒光技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染的 靈 敏 度 、 特 異 度 以 及 準(zhǔn) 確 性 分 別 為 85.44% 、 86.11%、85.71%。熒光探針PCR技術(shù)檢測診斷的 靈 敏 度 、特 異 度 以 及 準(zhǔn) 確 性 分 別 為 99.03% 、 97.22%、98.29%,兩者相比熒光探針PCR技術(shù)檢 測診斷患兒RSV感染的各項診斷效能均優(yōu)于免 疫熒光技術(shù)檢測,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
3 討論
數(shù)據(jù)統(tǒng)計,目前國內(nèi)每年死于急性呼吸道感 染的患兒約有10萬,其中在部分經(jīng)濟(jì)發(fā)展較為滯 后的省市急性呼吸道感染患兒的病死率更高,嚴(yán) 重影響兒童的身體健康和生命安全。根據(jù)感染病原體的不同,主要分為細(xì)菌感染和病毒感染,以 后者的占比更大,高達(dá)90%。其中RSV是導(dǎo)致兒童 急性呼吸道感染的常見病原體,也是目前全球范 圍內(nèi)公認(rèn)的誘發(fā)兒童急性肺炎和毛細(xì)支氣管炎的 最為主要的病原體。在發(fā)生RSV呼吸道感染時,缺乏特異性的臨床癥狀及表現(xiàn),依靠其進(jìn)行鑒別 診斷的難度較高。
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