伊曲康唑(圖 1)，分子式為 C35H38Cl2N8O4，是臨 床應(yīng)用廣泛的抗真菌藥物，屬于三唑類(lèi)抗真菌藥物家 族的關(guān)鍵成員．它存在于世界衛(wèi)生組織的基本藥物 清單上，是基本衛(wèi)生系統(tǒng)中最重要的藥物之一，其安 全性毋庸置疑．目前可用的口服抗真菌劑伊曲康唑 是一種有效的 Hedgehog 途徑拮抗劑，通過(guò)抑制羊毛固醇 14α 去甲基化酶(麥角固醇合成的關(guān)鍵酶)破 壞真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，從而使真菌生長(zhǎng)受到有效抑制。

1 材料與方法

1.1 材料

人慢性髓原白血病細(xì)胞株 K562、人早幼粒白血 病細(xì)胞株 HL-60、人急性 T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株 Jurkat、人結(jié)腸癌細(xì)胞株 HCT-116、人肝癌細(xì)胞株 HepG2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC，以上細(xì)胞株均 由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院藥物設(shè)計(jì)與合成研究 室保存．人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-468，美國(guó)菌種保藏 中心(ATCC)． PRMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM/F12(1﹕1)培養(yǎng) 基、DMEM 低糖培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基、青霉 素–鏈霉素溶液、巴西胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶(1×) 溶液，賽默飛世爾科技公司． 伊曲康唑，分析純，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公 司；喜樹(shù)堿(CPT)，分析純，北京偶合科技有限公司； MTT、RNase，北京索萊寶科技有限公司；濃鹽酸、異 丙醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲基 亞砜，分析純，美國(guó) Amresco 公司；Annexin V-FITC 凋亡試劑盒，天津三箭生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙 醇，分析純，天津市盛迪達(dá)貿(mào)易有限公司；碘化丙啶 (PI)，西格瑪奧德里奇中國(guó)有限公司；Triton X-100， 寶生物工程(大連)有限公司． 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；Model 3100 series 型 CO2 培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技公司；TX323L 型電 子分析天平，島津國(guó)際貿(mào)易有限公司；Infinite F50 型 基礎(chǔ)酶標(biāo)儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；CKX41 型奧 林巴斯倒置顯微鏡，奧林巴斯(中國(guó))有限公司；TISR 型尼康熒光倒置顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公 司 ；循環(huán)水 式 真 空 泵 、LX–300 型 迷你離心機(jī) 、其林貝爾VORTEX–6 型漩渦混合器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；342976 型流式細(xì)胞儀，碧迪醫(yī)療器械 (上海)有限公司；YXQ–LS–50SI 型立式壓力蒸汽滅 菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司．

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率．將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期的 K562 細(xì)胞、HL-60 細(xì)胞、Jurkat 細(xì)胞、HCT-116 細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞、MDA-MB-468 細(xì)胞以及 HUVEC 細(xì)胞，1×PBS 清洗后分別用 0.25% 胰蛋白酶消化(貼壁細(xì)胞)，接種于 96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度為 5×104 mL-1 ，每孔接種體積為 100 µL．將孔板置于 37 ℃、 5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育一定時(shí)間(懸浮細(xì)胞孵育 2 h， 貼壁細(xì)胞孵育 24 h)．每組設(shè) 3 個(gè)平行孔，每孔加入 化合物體積為 0.5 µL．伊曲康唑?qū)嶒?yàn)組和 CPT 陽(yáng)性 對(duì)照組的加藥終濃度為 0.01、0.1、1、10、100 µmol/L. 同時(shí)，設(shè)置等體積 DMSO 溶劑為對(duì)照組．將孔板置 于 37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱孵育 48 h 后，每孔加入 5 mg/mL MTT 20 µL，繼續(xù)孵育 4 h 后終止培養(yǎng)．貼壁 細(xì)胞吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入 100 µL DMSO；懸浮 細(xì)胞每孔直接加入 100 µL 鹽酸–異丙醇溶液后吹打 混勻，置于 37 ℃培養(yǎng)箱中 10 min 使甲 結(jié)臜 晶充分溶 解后，使用酶標(biāo)儀(貼壁細(xì)胞選擇 490 nm、620 nm； 懸浮細(xì)胞選擇 580 nm、620 nm)測(cè)定吸光度(A)．按 照式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率，并計(jì)算半數(shù)有效抑制濃度 IC50值． = 100% 實(shí)驗(yàn) 空白 對(duì)照 空白 細(xì)胞存活率 − × − A A A A (1)

1.2.2 K562 細(xì)胞增殖曲線繪制

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 K562 細(xì)胞以細(xì)胞密度為 5×104 mL-1 接種于 24 孔板上，每孔 1 mL，同時(shí)設(shè)置 對(duì)照孔；37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 h，分別加入 終濃度為 1、3、10、30 µmol/L 伊曲康唑，每孔 5 µL．對(duì)照孔為細(xì)胞懸液中僅加入含相同濃度 DMSO．再將孔板置于 37 ℃、5% CO2 恒溫培養(yǎng)箱 中，孵育 0、24、48、72、96、120 h，對(duì)不同處理時(shí)間不 同加藥濃度的細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組細(xì)胞計(jì)數(shù) 3 次，計(jì)算平均值并使用 GraphPad Prism 5 進(jìn)行數(shù)據(jù) 分析．

1.2.3 K562 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 K562 細(xì)胞以 5×104 mL-1 細(xì)胞密度接種于 6 孔板，每孔 2 mL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照 孔．孔板置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 h，分別 加入伊曲康唑終濃度為 1、3、10、30 µmol/L，每孔 10 µL ．對(duì) 照 孔 細(xì) 胞 懸 液 中 僅加入相 同 體 積 DMSO．再將孔板置于 37 ℃、5% CO2 恒溫培養(yǎng)箱中 分別孵育 24 h 和 48 h，在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)使用顯微鏡 觀察 K562 細(xì)胞的形態(tài)變化，并進(jìn)行圖像采集．

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)伊曲康唑?qū)?K562 細(xì)胞凋亡的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 K562 細(xì)胞以 5×104 mL-1 細(xì)胞密度接種于 6 孔培養(yǎng)板，每孔 2 mL，置于 37 ℃1、3、10、30 µmol/L 的伊曲康唑；培養(yǎng)箱孵育 48 h 后，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清液，用預(yù)冷的 1× PBS 吹懸細(xì)胞，2 500 r/min 離心 5 min，再次棄去上清 液，冰浴；加入 100 µL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞， 轉(zhuǎn)移至室溫下進(jìn)行染色．首先，加入 5 µL Annexin VFITC，輕輕振蕩混勻，避光孵育 10 min；然后再加入 20 µg/mL PI 5 µL，輕輕吹打混勻，避光孵育 5 min；最 后補(bǔ)加 400 µL 1×Binding Buffer 并立即使用流式細(xì) 胞儀進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)需在 1 h 內(nèi)完成，防止 FITC 及 PI 熒光淬滅影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性．

2 結(jié)果與分析

通過(guò) MTT 法對(duì) 6 株不同的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了體外 抗腫瘤活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)伊曲康唑?qū)Π籽〖?xì)胞，尤其 是 K562 細(xì)胞的抑制作用最為顯著．伊曲康唑 抑制 K562、HL-60 細(xì)胞增殖的 IC50 值分別為(3.04± 2.30)、(6.62±1.74)µmol/L，而伊曲康唑抑制 Jurkat、 HCT-116、HepG2 及 MDA-MB-468 細(xì)胞增殖的 IC50 值均大于 100 µmol/L．本文選擇 K562 細(xì)胞株展開(kāi)伊 曲康唑抗腫瘤作用的后續(xù)研究．通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡(放大 400 倍)觀察發(fā)現(xiàn)：空白對(duì)照組的 K562 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較 旺盛，形態(tài)呈圓形，整體光亮；而伊曲康唑處理后 K562 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體、細(xì)胞變長(zhǎng)或細(xì)胞皺縮的現(xiàn) 象．細(xì)胞凋亡的早期主要表現(xiàn)為包漿形成空泡，空泡 與細(xì)胞分離后最終導(dǎo)致細(xì)胞破碎形成凋亡小體．細(xì) 胞形態(tài)呈長(zhǎng)條狀則提示伊曲康唑?qū)?K562 細(xì)胞的細(xì) 胞周期可能存在阻滯的作用．于是，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn) 中進(jìn)一步驗(yàn)證伊曲康唑?qū)?K562 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周 期的影響．

3 討 論

2017 年 6 月 30 日，中國(guó)侵襲性真菌感染工作組 報(bào)道了侵襲性真菌病(invasive fungal disease，IFD)是 血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者重要的死亡原因之一，血液病 患者 IFD 的總體發(fā)病率不斷呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，即使接 受造血干細(xì)胞移植后，IFD 病死率仍高達(dá) 50% ．值 得注意的是，IFD 的預(yù)防治療與經(jīng)驗(yàn)治療策略中，伊 曲康唑都被作為推薦使用的抗真菌藥物之一．



 

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