完整的血管結(jié)構(gòu)是維持頸脊髓正常功能的重要基礎(chǔ)， 頸脊髓損傷后伴隨的微血管損傷將導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的進 一步加重。鑒于頸脊髓損傷的病理過程與微血管結(jié)構(gòu)破 壞密切相關(guān)，為了評估微血管在頸脊髓損傷過程中的參 與程度或衡量治療策略的效果，首先需要對正常頸脊髓微 血管結(jié)構(gòu)的空間分布進行良好的三維可視化和精確的量化 分析研究。

于2018年10至12月在南方醫(yī)科大學(xué)南 方醫(yī)院脊柱脊髓損傷研究實驗室完成。

5只成年雄性Sprague-Dawleley大鼠，體質(zhì)量 280-320 g，均購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證 號：NFYY-2016-119。所有動物操作程序均根據(jù)國家相關(guān) 實驗動物使用準(zhǔn)則施行，并獲得南方醫(yī)科大學(xué)動物使用倫 理委員會的批準(zhǔn)。

1.4 方法

1.4.1 灌注劑制備

將生理鹽水、硫酸鋇粉末(Sachtleben 公司，德國)、醫(yī)用明膠(Aladdin公司，中國)按照20∶5∶1 混合，置于37 ℃磁力攪拌器GL-6250B(海門市其林貝爾)持續(xù)攪 拌，直到明膠完全溶解且混合液均勻混合，約為2 h。硫酸 鋇參數(shù)對比見表1。

1.4.2 血管灌注

采用的灌注材料和方法參考既往相關(guān) 報道。具體步驟如下：
①腹腔注射戊巴比妥鈉對大鼠 進行深度麻醉，采用胸腹切口立即暴露心臟、肝臟和腸道，將22號鈍性穿刺針經(jīng)心尖插入主動脈；
②肝素生理鹽水灌注 沖洗，直至循環(huán)血液被有效清除，血管內(nèi)流動液體清亮，肝 臟表面變?yōu)榘咨?br /> ③采用40 g/L多聚甲醛對大鼠進行灌洗固 定，直至身體及尾巴的明顯硬化；
④注射灌注劑混合液, 直 到肝小葉和腸壁血管完全呈白色。(所有灌注溶液、肝素化 鹽水、甲醛和硫酸鋇均預(yù)熱至37 ℃，灌注過程中采用恒壓 灌注)；
⑤然后取出鈍性穿刺針，將主動脈結(jié)扎，防止灌注 液滲漏，將灌注后的大鼠置于在4 ℃過夜；⑥行頸后正中切 口，逐層分離，顯露頸椎，咬除椎板，切取C3-C7節(jié)段脊髓 組織。取材操作在顯微鏡下進行，避免損傷脊髓結(jié)構(gòu)。

1.4.3 三維可視化與量化分析

將頸脊髓組織置于 micro-CT中(μCT 80，Scanco公司，AG，瑞士)，掃描層 厚為10 μm，參數(shù)設(shè)定為55 kV，145 μA，300 ms。脊髓 組織掃描后定義圍繞脊髓外緣為脊髓輪廓，通過調(diào)節(jié)灰度 閾值聯(lián)合三維高斯噪聲濾波器，將灌注微血管結(jié)構(gòu)與脊髓 組織分離，采用距離變換法計算血管直徑，將不同直徑血 管賦以相應(yīng)偽彩。對相應(yīng)節(jié)段頸脊髓微血管進行量化分析， 分析指標(biāo)包括：血管體積與組織體積比值、血管表面積與 組織體積比值、血管數(shù)目、血管直徑、血管分離度、連接 密度、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)以及不同直徑微血管的數(shù)量、百分比 及體積。

1.5 主要觀察指標(biāo)

利用硫酸鋇灌注聯(lián)合micro-CT掃描 對正常大鼠頸脊髓微血管進行三維可視化和量化分析。

三維可視化是描繪和 理解模型的一種手段，是數(shù)據(jù)體的一種表征形式，以大量 數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，檢查研究對象的連續(xù)性，發(fā)現(xiàn)并提出異常， 為分析、理解及重復(fù)數(shù)據(jù)提供依據(jù)。頸脊髓組織完成 micro-CT掃描后，依據(jù)脊髓的外緣輪廓定義脊髓結(jié)構(gòu)，所 得到的圖像通過調(diào)節(jié)灰度閾值聯(lián)合三維高斯噪聲濾波器， 將灌注微血管結(jié)構(gòu)從脊髓組織體積中分割出來，獲得頸脊 髓微血管三維重建圖像，可以清晰顯示頸脊髓的前、后動 脈，以及分支動脈。采用距離變換法計算血管直徑，將不同直徑血管賦以 相應(yīng)色彩，實現(xiàn)頸脊髓微血管三維結(jié)構(gòu)的彩色可視化，見 圖3。通過量化分析微血管指數(shù)，結(jié)果顯示，血管體積與組 織體積比值為0.022±0.002、血管表面積與組織體積比值為 (52.370±6.271) mm-1、血管數(shù)目為(0.604±0.076) mm-1、 血管直徑為(0.040±0.005) μm、血管分離度為(1.762± 0.255) μm、連接密度為(2.661±0.757) mm-3、結(jié)構(gòu)模型指 數(shù)為4.400±0.129。

保持完整的微血管結(jié)構(gòu)是維持頸脊髓正常功能的重要 基礎(chǔ)的關(guān)鍵基礎(chǔ)，在急性脊髓損傷后，脊髓組織切片染色 表現(xiàn)為損傷區(qū)域的基本結(jié)構(gòu)殘存，而微血管系統(tǒng)出現(xiàn)中斷、 移位、扭曲，組織學(xué)切片染色是檢測脊髓微血管變化的 重要方法，但存在顯著的不足：組織冰凍切片及染色過程 通常耗時較多；該方法破壞了脊髓標(biāo)本的三維結(jié)構(gòu)完整 性，只能提供血管系統(tǒng)的二維圖像，無法實現(xiàn)脊柱微血管 網(wǎng)絡(luò)的三維成像和精確定量分析。目前脊髓微血管的 三維可視化已成為一個極具吸引力的研究領(lǐng)域。在成像 研究中，造影劑灌注通常用于顯示血管網(wǎng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 用于micro-CT成像的血管造影劑必須具有較低的黏度，并 具有較高分子質(zhì)量，以便能夠?qū)⑻畛鋵Ρ葎┑奈⒀芘c周 圍的軟組織區(qū)分開。許多材料可用做對比劑，例如 碘、液態(tài)油脂、樹脂、金納米顆粒和3種最常用的鉛氧化物、 硫酸鋇和microfil。此次研究通過硫酸鋇灌注聯(lián)合 micro-CT掃描，實現(xiàn)了對大鼠正常頸脊髓微血管結(jié)構(gòu)良好 的三維可視化和精確的量化分析研究。

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