膽囊癌是消化道常見(jiàn)惡性腫瘤，分為原發(fā)性和 繼發(fā)性。原發(fā)性膽囊癌可發(fā)生于膽囊任何部位，以 膽囊底及膽囊頸多見(jiàn)。原發(fā)性膽囊癌的發(fā)病率 在消化道腫瘤居第 5 位。繼發(fā)性膽囊癌所占極少一 部分，主要來(lái)自消化系腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。近年 來(lái)，很多文獻(xiàn)報(bào)道，黏液蛋白在炎癥向腫瘤的進(jìn)展過(guò) 程中起到了很重要的作用。黏蛋白 16( mucin16， MUC16) 基因是編碼 CA125 的基因，是一種由各類(lèi) 上皮細(xì)胞表達(dá)的高分子量糖蛋白，其在上皮細(xì)胞表 面發(fā)揮保護(hù)和修復(fù)上皮的作用。

1． 材料

人膽囊癌細(xì)胞系( GBC-SD) 細(xì)胞購(gòu)自深圳市豪 地華拓生物科技有限公司( HTX1663) 。人 MUC16 質(zhì)粒 購(gòu) 自 上 海 泰 冷 生 物 科 技 有 限 公 司 ( TV094025001) 。PI3K 抑制劑 BKM120 購(gòu)自上海 邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司( M29995) 。Lipo2000 購(gòu) 自 Thermo Fisher Scientific 公司( 11668027) 。ＲPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自 GE Health 公司( SH30091) ，F(xiàn)BS 購(gòu)自 Thermo Fisher Scientific 公 司 ( 10099-133 ) 。 MUC16、MMP-9、p-Akt、Akt，抗微管蛋白( tubulin) 抗 體購(gòu)自 abcam 公司( ab1107，ab73734，EP2109Y， ab85683，ab7291) 。抗 PI3K 抗 體 購(gòu) 自 CST 公 司 ( 4249) 。蛋白酶抑制劑 Cocktail ( 不含 EDTA，小片 劑) 購(gòu)自 Bimake 公司( B14011) 。PBS 購(gòu)自上海生 工生 物 工 程 股 份 有 限 公 司 ( E607008) 。TＲIzolTM Ｒeagent 購(gòu)自成都東勝科創(chuàng)科 技有限公司 ( 15596026) 。青鏈霉素混合液( ×100) 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司( P1400) 。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上 海海方生物技術(shù)有限公司( A0005) 。Ｒeal-time PCＲ 試劑盒購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司( 600828) 。 2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生 物技術(shù)有限責(zé)任公司( WB-0081) 。蛋白裂解液購(gòu)自 上海碧云天生物技術(shù)有限公司( P0013) 。MMP-9 和 MUC16 的 siＲNA 序列由上海生工生物工程股份有 限公司合成，序列見(jiàn)表 1。GAPDH、MMP-1、MMP-2、 MMP-3、MMP-7、MMP-8 和 MMP-9 的 Ｒeal-time PCＲ 引物由上海生工生物工程有限公司合成。 Western blotting 裝 置 ( Bio-rad ) ; 酶 標(biāo) 儀 ( Thermo Fisher Scientific 公司) ; 細(xì)胞培養(yǎng)箱( Thermo Fisher Scientific 公 司 ) ; 生 物 安 全 柜 ( Thermo Fisher Scientific 公司) ; 微量加樣器( Gilson 公司) ; 冷凍離 心機(jī)( Eppendorf 公司) ; 旋轉(zhuǎn)搖床( 海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司) ; 脫色搖床( 北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀 器有限公司) 。

2． 方法

維 持在補(bǔ)充有 2 mmol /L L-谷氨酰胺、0. 1IU /L 青霉素、100 mg /L 鏈霉素和 10%熱滅活 FBS 的 ＲPMI1640 培養(yǎng)基中，并在潮濕氣氛( 37 ℃，5%CO2 ) 中培 養(yǎng)。BKM120 以終濃度 5 μmol /L 處理人膽囊癌細(xì) 胞 GBC-SD，8 h 后 收 獲 細(xì) 胞。通 過(guò) Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染人膽囊癌細(xì)胞 GBC-SD。將含目的基因的 質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，靜止大約 20 min 后，緩緩滴入 GBC-SD 細(xì)胞。每 106 個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染 4 μg MUC16 質(zhì)粒。 siMUC16 和 siMMP-9 的轉(zhuǎn)染濃度為 100 nmol /L。 2. 2 ＲNA 抽取和 Ｒeal-time PCＲ: 將 GBC-SD 細(xì)胞 用細(xì)胞刮刮下，裝入 1. 5 ml 的 EP 管中，用 PBS 洗 3 次。使用 Trizol 抽取 GBC-SD 的總 ＲNA。使用反轉(zhuǎn) 錄試劑盒將純化好的總 ＲNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再使用 GAPDH、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8 和 MMP-9 的 Ｒeal-time PCＲ 引物和熒光定量 PCＲ 試劑 盒在 ABI7500 儀器上進(jìn)行 Ｒeal-time PCＲ 反應(yīng)，實(shí)驗(yàn) 重復(fù) 3 次。進(jìn)行 8%或 10% SDS-PAGE 的凝 膠 電 泳，然 后 轉(zhuǎn) 移 到 Immobilon-P PVDF 膜 ( 0. 45 μm 孔 徑) 。將 PVDF 膜在室溫下用含有 0. 01% Tween-20 和 5%脫脂奶粉的 Tris 緩沖液( 10 mmol Tris-HCl，pH 7. 5，150 mmol /L NaCl) 封閉 1 h， 然后在 4 ℃ 下與 MUC16( 鼠，1 ∶1000) ，MMP-9( 兔， 1 ∶3000) ，p-Akt ( 兔，1 ∶ 1000) ，AKT ( 兔，1 ∶ 2000) ， PI3K( 兔，1 ∶3000) ，微管蛋白( 鼠，1 ∶10 000) 抗體溫 育過(guò)夜。然后將膜在室溫下與綴合有 HＲP 的相應(yīng) 二抗( 鼠抗兔: 1 ∶ 4000，兔抗兔: 1 ∶ 4000) 孵育 1 h。 觀察特定蛋白質(zhì)使用 ECL Plus Western blotting 跡檢 測(cè)系統(tǒng)。96 孔板中分配 100 μl EC109 細(xì)胞懸浮 液( 5000 個(gè)細(xì)胞/孔) 。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)孵 育 24 h( 37 ℃，5%CO2 條件下) 。將 10 μl 不同濃度 的待測(cè)物質(zhì)加入板中。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適 當(dāng)?shù)臅r(shí)間( 0 d、1 d、2 d、3 d、4 d) 。向板的每個(gè)孔中 加入 10μl CCK-8 溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育 4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量 450 nm 處的吸光度。

3 結(jié)果

用 MUC16 質(zhì) 粒 過(guò) 表 達(dá) MUC16 蛋 白 后，通 過(guò) Ｒeal-time PCＲ 實(shí) 驗(yàn)，發(fā) 現(xiàn) MMPs 家 族 中 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8 與對(duì)照組差異無(wú)顯 著性( P＞0. 05) ，而 MMP-9 的 mＲNA 水平明顯升高， 此差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05) 。 2． MUC16 通過(guò)激活 PI3K /Akt 通路促進(jìn) MMP-9 的表達(dá)過(guò)表達(dá) MUC16 后，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， MMP-9、p-Akt、PI3K 的蛋白水平明顯升高，而 Akt 蛋 白的總量無(wú)明顯變化。而敲低 MUC16 后，通過(guò)免疫 印跡，發(fā)現(xiàn) MMP-9、p-Akt、PI3K 的蛋白水平明顯降 低，而 Akt 蛋白的總量無(wú)明顯變化。在 過(guò) 表 達(dá) MUC16 的基礎(chǔ)上再使用 PI3K /Akt 通路的抑制劑 BKM120 處理后，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，p-Akt、 PI3K、MMP-9 和 Akt 蛋白的總量無(wú)明顯變化。

4 討論 

源于膽囊上皮的膽囊癌是膽道系統(tǒng)中最常見(jiàn) 的惡性腫瘤。手術(shù)切除是目前已知的唯一確 定有效的治療手段，但手術(shù)切除率低于 30%，只有 5. 2% ～ 22%的患者有條件施行治愈性手術(shù)。一 旦患者出現(xiàn)嚴(yán)重腹疼、黃疽、體重減輕和膽囊包塊等 膽囊癌的典型癥狀和體征，疾病即已進(jìn)入進(jìn)展期，幾 乎沒(méi)有完全切除的可能。膽囊癌的預(yù)后極差，主 要原因是腫瘤發(fā)展迅速，在臨床出現(xiàn)癥狀之前較早 發(fā)生周?chē)M織的侵犯和肝臟及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移腫瘤的侵襲 轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的決定因素之一，對(duì)轉(zhuǎn)移的機(jī) 制和抗轉(zhuǎn)移研究是近年來(lái)腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)和抗癌 治療的突破方向。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，MUC16 激活 PI3K /Akt 通路促進(jìn) MMP-9 的蛋白表達(dá)，進(jìn)而 提升膽囊癌細(xì)胞 GBC-SD 的細(xì)胞活力和遷移能力。