人乳頭瘤病毒( HPV) 是目前被確定的可引起宮 頸癌的病因。所以控制 HPV 感染可以有效控制宮頸 癌的發(fā)生。人類的皮膚黏膜是其天然宿主,皮膚和 黏膜的破損是 HPV 感染的啟動條件,HPV 病毒通過 受損的上皮組織進入基底層細胞,在細胞內(nèi)復制繁殖, 其復制周期受到嚴格的調(diào)控,并依賴于病毒編碼的蛋 白質(zhì)和宿主上皮細胞的分化程度。皮膚和黏膜是 預防 HPV 感染的第一道屏障,任何影響和破壞這道屏 障的因素都可以誘發(fā) HPV 的感染。陰道微環(huán)境是黏 膜屏障新陳代謝的基礎,所以陰道微環(huán)境與 HPV 的感 染有很密切的關系。
1 資料與方法
1. 1 一般資料
2017 年 3 月至 2018 年 3 月在我院自 愿進行 HPV 基因分型檢測的 462 例女性患者,年齡 20 ~ 82 歲,其中 30 ~ 50 歲女性最多。嚴格按照試劑說明 書或微生物采集手冊采集方法及注意事項采集,運送 及貯存標本。采用 PCR-反向點雜交技術檢測 HPVDNA 的分型情況,使用陰道炎聯(lián)檢試劑盒( 化學反應 法) 檢測陰道微生態(tài)情況。
1. 2 儀 器
與 試 劑 HPV 分型基因測試盒和 ABI StepOnePlus 基因擴增儀均由艾康生物科技有限公司 提供; 分子雜交儀購自興化市分析儀器廠; 臺式高速冷 凍離心機來自湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司; 式恒溫器,微型混合器,微型離心機均來自海門市其林貝爾儀器制造有限公司,移液器由賽默飛世爾儀器有限公 司提供。
1. 3 方法
1. 3. 1 樣本采集及保存
先按照陰道炎聯(lián)檢試劑盒使 用說明書標本采集要求,采集白帶標本。再由醫(yī)生以 擴陰器暴露宮頸口,先用棉拭子將宮頸口過多的分泌 物擦去,檢測標本為宮頸黏膜上皮細胞,最好為鱗-柱 交界處的上皮細胞。取柔軟的宮頸刷伸入宮頸,通過 鱗-柱交界處,直到看不到刷子頭,旋轉(zhuǎn) 10 ~ 20 s,取 出,將其放入細胞保存液中,密閉送檢,并注明惟一編 號,將兩份標本同時盡快送檢。
1. 3. 2 陰道炎聯(lián)檢試劑盒檢測檢測方法及結果判讀
將沾有標本的拭子取出,置于反應管中加 6 滴標本提 取夜,反復擠壓棉簽使樣本溢出。將溢出標本液滴于 測試卡的孔位于 35 ~ 37℃溫育 15 min,然后在 β-N-乙 酰氨基酸葡萄糖苷酶( NAG) 和唾液酸酐酶( SNA) 滴 加一滴顯色夜,2 min 后立即判讀結果。過氧化氫酶 H2O2 顯示紫紅色為陰性,提示正常,不顯色表示陽性, 提示菌群失調(diào); 白細胞酯酶( LE) 不顯色表示陰性,提 示正常; 顯藍色或綠色表示陽性,提示有炎癥; PH 值 > 4. 5 為異常,有利于致病菌侵入及生長; β-葡聚糖醛 苷酸酶( GUS) 不顯色表示陰性,提示正常; 顯藍色或綠 色表示陽性,提示有大腸埃希菌等需氧菌感染; 唾液酸 酐酶( SNA) 不顯色或顯黃色表示陰性,提示正常; 顯藍 色或綠色表示陽性,提示有細菌性陰道病; β-N-乙酰氨 基酸葡萄糖苷酶( NAG) 不顯色表示陰性,提示正常; 顯黃色表示陽性,提示陰道保護性黏膜蛋白屏障被破 壞,陰道黏膜處于易感狀態(tài)或已被白色念珠菌等微生 物感染。
1. 3. 3 HPV-DNA 的提取及擴增
取出保存的標本平 衡室溫 1 ~ 2 h,對標本和對應 1. 5 ml 離心管管進行惟 一編號,震蕩混勻標本,取 1 ml 混懸液于已編碼的 1. 5 ml離心管中12 000 r/min 離心10 min,去上清液加 50 μl 核酸提取液,100℃干浴器10 min 后12 000 r/min 離 心 10 min,取 5 μl 核酸提取液加入 45 μl 的核酸反應 液,擴增產(chǎn)物如不能立即使用,密封放于 - 20℃冰箱保 存?zhèn)溆谩U增時間設定為: 50℃ 2 min; 95℃ 15 min; 94℃ 30 s,45℃ 1 min,72℃ 30 s,進行 50 個循環(huán); 72℃ 延伸 10 min。
1. 3. 4 雜交、洗膜和顯色
按照雜交液試劑配置說明 新鮮配置溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、結合液和顯色液。 雜交: 將 5 ml 溶液Ⅰ加入到 15 ml 塑料管中,膜條按照 樣本編碼進行標記放入 15 ml 塑料管中,然后依次加入 50 μl PCR 擴增產(chǎn)物,擰緊蓋子,于 42℃雜交儀中雜 交 60 min,同時將 50 ml 溶液Ⅱ于雜交儀中預熱至 42℃。洗膜: 雜交結束后取出膜條,轉(zhuǎn)移至預熱 50 ml 溶液Ⅱ的管中,42℃雜交儀中洗滌 10 min。顯色: 新鮮 配置結合液,膜條裝入結合液管中,于室溫搖床輕搖 10 min; 取出膜條放入 50 ml 溶液Ⅰ管中室溫輕搖洗 2 次,5 min /次,再用 50 ml 溶液Ⅲ室溫搖洗 2 min。新 鮮配 置 顯 色 液,將膜條浸泡于顯色液中輕搖 5 ~ 10 min,最后將膜條移至純水中終止顯色。將膜條展 開在白紙上,根據(jù)檢測位點的信號觀察結果。
1. 4 統(tǒng)計學分析
應用 SSPS 24. 0 統(tǒng)計軟件,計數(shù)資 料比較采用 χ2 檢驗,P < 0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
462 例患者 進行 25 種 HPV 基因型檢測,其中包括 14 種高危型: HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73; 3 種疑似高危型: HPV26、53、66; 8 種低危型: HPV6、 11、40、42、43、44、81、83。除高危型 HPV45 和低危型 HPV40 無人感染外,其余類型均有感染。462 例患者 HPV 陽性感染率為 19. 5% ( 90 /462% ) ,感染高危型 HPV 的患者 65 例,感染率為 14. 1% ( 65 /462% ) ,占 HPV 陽性的 72. 22% ( 65 /90% ) ,感染低危型 HPV 的 16 例,感 染 率 3. 5% ( 16 /462% ) ,占 HPV 陽 性 的 17. 78% ( 16 /90% ) ; 感染疑似高危型 HPV 的 9 例,感 染 率 1. 9% ( 9 /462% ) ,占 HPV 陽 性 的 10% ( 9 / 90% ) 。單一型感染有 61 例,占 HPV 陽性的 67. 78% ( 61 /90% ) 兩型及以上感染的有 29 例,占 HPV 陽性的 32. 22% ( 29 /90% ) 。90 例 HPV 感染陽性患者檢出不同型別數(shù)合計 122 次,對多重感染者,各型別分別單獨計算。20 ~ < 30 歲、30 ~ < 40 歲、40 ~ < 50 歲和50 ~ < 60 歲4 組 感染 HPV 患者數(shù)比較,40 ~ < 50 歲最多 56 例,30 ~ < 40 歲有 34 例感染,20 ~ < 30 歲有 16 例,50 ~ < 60 歲 有 13 例感染,65 歲和 82 歲分別有 1 例感染 HPV16 型,1 例 72 歲患者感染 HPV31 型。表 2 顯示高危型 HPV16 是感染最多的型別,感染率為 16. 39% ( 20 / 122% ) ,明顯高于其他 HPV 型別。
3 討論
HPV 廣泛存在,人類的 HPV 感染率很高。在自 然人群中,HPV 感染率從低于 1% 到高達 50% ,在性 活躍人群中 20% ~ 80% 的人有 HPV 感染史。HPV 侵入人體后,停留于感染部位的皮膚和黏膜中,并進行 增殖,不進入血液,也不產(chǎn)生病毒血癥。20 世紀 70 年代德國人哈拉爾德·楚爾·豪森提出 HPV 與宮頸 癌有關系,1995 年國際癌癥學會確定: HPV 是宮頸癌 的主要病因。2008 年 10 月 6 號哈拉爾德·楚爾·豪 森因發(fā)現(xiàn) HPV 獲得諾貝爾獎。此后經(jīng)過科學家及醫(yī) 學專家多年的研究證明,高危型 HPV( 人乳頭瘤病毒) 持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的的比較明確的病因。
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