氣血理論是中醫(yī)基礎(chǔ)理論之一,由于氣虛原因出 現(xiàn)血不循經(jīng)、溢出脈外的情況被稱為氣不攝血證。氣 不攝血證常見于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中免疫性血小板減少癥 (immune thrombocytopenia,ITP)、再生障礙性貧 血、膿毒癥、上消化道出血等疾病,尤以 ITP 氣不攝血證研究較多?,F(xiàn)代研究顯示,ITP 是由自身 免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的血小板計數(shù)暫時或持續(xù)減少的臨床 常見的出血性疾病之一。以往對 ITP 的研究多集中在 免疫系統(tǒng)方面,然而臨床上部分 ITP 患者出現(xiàn)血小板 計數(shù)重度減少,并未出現(xiàn)明顯出血癥狀,出現(xiàn)上述 情況可能是由于血管內(nèi)皮損傷的程度不一。
1 實驗材料
1.1 動物
健康 SPF 級 Balb/C 小鼠,雌雄各半,8 周齡,體質(zhì)量 18~22 g,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公 司,動物生產(chǎn)許可證號 SCXK(京)2016-0006,動物 質(zhì)量合格證號 11400700313965、11400700319519、 11400700311207、11400700311181;健康普通級豚鼠, 雌性,8 周齡,體質(zhì)量 200 g,北京芳元緣養(yǎng)殖場,動 物生產(chǎn)許可證號 SCXK(京)2014-0012,動物質(zhì)量合 格證號 11804900011954;健康 SPF 級 Balb/C 小鼠, 雄性,8 周齡,體質(zhì)量 18~22 g,北京維通利華實驗 動物技術(shù)有限公司,動物生產(chǎn)許可證號 SCXK(京) 2016-0006,動物質(zhì)量合格證號 11400700335844。飼 養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實驗動物中心 SPF 級 實驗動物室,溫度 20~26℃,相對濕度 40%~70%, 晝夜 12 h 交替,自由攝食飲水。飼料由北京科澳協(xié)力 飼料有限公司提供,飲用水為滅菌水,每日更換。
1.2 試劑
ACD 抗凝劑(A),北京百奧萊博科技有限公司, 批號 0511A18;水合氯醛,國藥集團化學(xué)試劑有限公 司,批號 T20080902;弗氏完全佐劑(FCA),美國 Sigma 公司,批號 SLBP0432V;弗氏不完全佐劑 (FICA),美國 Sigma 公司,批號 SLBS4985;PBS, 北京索萊寶科技有限公司,批號 20180419;小鼠 vWF ELISA 檢測試劑盒,北京安迪華泰科技有限公司,批 號 HT20378;小鼠 NO ELISA 檢測試劑盒,Andygene 公司,批號 HT20367;小鼠 ET-1 ELISA 檢測試劑盒, 北京安迪華泰科技有限公司,批號 HT20379;小鼠 AimPlex 流式高通量多因子 VEGF-A、sICAM-1、 sVCAM-1 檢測試劑盒,北京曠博生物技術(shù)有限公司, 批號 18101608。
1.3 儀器
全自動血細胞分析儀(NIHOH KOHDEN 公司, MEK-6318K),電子天平(長沙湘平科技發(fā)展有限公 司,ES-1100;北京賽多利斯儀器有限公司,TP-213), 流式細胞分析儀(BD 公司,Calibur),高速冷凍離心 機(賽默飛世爾科技公司,CL31R),大小鼠抓力測 定儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司,YLS-13A),酶 標儀(Labsystems Multiskan MS,352),醫(yī)用離心機 (北京白洋醫(yī)療器械有限公司,BY-160A),渦旋器 (其林貝爾儀器制造有限公司,其林貝爾QL-861)。
2 實驗方法
2.1 豚鼠抗血小板血清制備
①制備抗原:取 Balb/C 小鼠,雌雄各半,3.5% 水合氯醛腹腔注射麻醉,摘出眼球取血,ACD(A) 抗凝,200×g 離心 10 min。取上層富含血小板血漿, 1700×g 離心 10 min,去上清液,0.1 mol/L、pH 7.4 PBS 沖洗血小板 3 次,調(diào)整血小板數(shù) 2×109 /L。②免疫:將 血小板分別與等量 FCA 和 FICA 混合,成油包水狀, 為 FCA 抗原和 FICA 抗原。取 FCA 抗原,于 0 周注射 豚鼠足掌、背及皮下,共 5 點,每點 200 μL,共 1000 μL。 取 FICA 抗原分別于 1、2、4 周在上述相同部位注射。 第 5 周豚鼠腹主動脈取不抗凝全血,室溫放置 1 h, 3500 r/min 離心 10 min,取上清液,置于-30 ℃冰箱 儲存。③紅細胞吸附:將 APS 從-30 ℃冰箱中取出, 置于 56 ℃水浴中 30 min 滅活補體。將等體積 5%Balb/C 小鼠紅細胞懸液加到 APS 中,37 ℃孵育 1 h,3500 r/min 離心 10 min,取上清液,上清液再按 上述方法吸附 2 次,即稀釋成 1∶4 濃度,備用。
2.2 造模
在前期研究基礎(chǔ)上,采用睡眠剝奪復(fù)合免疫方 法進行造模。睡眠剝奪:將小鼠置于自制水平臺 (水平臺規(guī)格:平臺高 40 mm、底盤直徑 60 mm、中 間豎管直徑 10 mm、頂盤直徑 25 mm)上,每籠 4 個 水平臺,放置 3 只小鼠。使用鐵絲網(wǎng)將睡眠剝奪籠蓋 住并固定,保證小鼠無法逃脫,但可以移動。食物與 飲用水瓶置于鐵絲網(wǎng)食槽內(nèi),使小鼠可自由攝食飲 水,若小鼠進入睡眠狀態(tài),會因肌肉松弛而落入水中, 從而使小鼠始終保持清醒狀態(tài)。采取隨機時間段剝奪 方法,平均每日剝奪 19 h。每日剝奪結(jié)束后,將小鼠 取出,放回鼠籠。免疫:按 100 μL/20 g 腹腔注射 APS, 隔日 1 次,共注射 7 次。造模:第 1 周進行睡眠剝奪, 第 2、3 周睡眠剝奪復(fù)合注射 APS 免疫。
2.3 分組
將雄性 Balb/C 小鼠分為正常組和模型組,各組再分為 7、10、21 d 共 3 個時間點,正常組每個時間 點各 10 只,模型組每個時間點各 12 只。模型組睡眠 剝奪 7 d 后,在睡眠剝奪同時,每隔 1 d 注射 APS; 正常組每隔 1 d 注射生理鹽水。每個時間點結(jié)束后, 小鼠摘眼球取血,常規(guī)制備血清,-80 ℃冰箱貯藏備 用,進行相應(yīng)指標檢測。
2.4 檢測指標
2.4.1 小鼠體征
觀察小鼠精神狀態(tài)、毛色、大便、出血情況等。
2.4.2 體質(zhì)量
測量小鼠體質(zhì)量。
2.4.3 抓力
使用大小鼠抓力測定儀測定小鼠抓力。
2.4.4 血小板計數(shù)
取小鼠尾靜脈血,使用全自動血細胞分析儀測量 血小板數(shù)量。
2.4.5 臟器指數(shù)
小鼠麻醉,取脾臟、胸腺,生理鹽水沖洗后稱重。 計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)(%)=臟器濕重(g)÷ 小鼠體質(zhì)量(g)×100%。
2.4.6 ELISA 檢測
血清血管性血友病因子、一氧化氮 和內(nèi)皮素-1 含量 -80 ℃冰箱取出小鼠血清,按 ELISA 試劑盒說明 書進行操作,檢測小鼠血清 vWF、NO、ET-1 含量。
2.4.7 流式法檢測
血清血管內(nèi)皮生長因子-A、可溶性 細胞間黏附分子-1、可溶性血管細胞黏附分子-1 含量 -80 ℃冰箱取出小鼠血清,按 AimPlex 流式高通 量多因子檢測試劑盒說明書進行操作,檢測小鼠血清 VEGF-A、sICAM-1、sVCAM-1 含量。
3 統(tǒng)計學(xué)方法
采用 SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以 — x±s 表示,組間比較用獨立樣本 t 檢驗。P<0.05 表示 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
4 結(jié)果
正常組小鼠精神狀態(tài)良好,反應(yīng)敏捷,活動性良 好,毛色純白有光澤,大便呈黃褐色,條狀,顆粒清 晰。第 7 日模型組小鼠精神狀態(tài)萎靡,反應(yīng)遲鈍,每 日停止睡眠剝奪后,倦怠蜷縮,極少活動,毛色黯黃 粗糙,大便呈黑褐色或黃色,便稀,隨時間延長日益 加重。第 10 日(注射 APS 后 3 d),小鼠腹部、腿部 出現(xiàn)出血點,便血情況出現(xiàn),第 2 次注射后, 小鼠出血最為嚴重,此后逐日減輕,第 21 日已無出 血情況。
5 討論
氣是構(gòu)成人體和維持人體生命活動的精微物質(zhì), 血為脈管中流動的紅色液體,二者相互作用,保證人 體機能的正常運行。在中醫(yī)理論中,血證有廣義與狹 義之分,其中廣義的血證是指與血液有關(guān)的疾病,狹 義的血證是指由于各種原因?qū)е碌难谎?jīng),溢出脈 外。氣不攝血是血證的常見病機,其辨證要點為出血 和氣虛。由于氣的統(tǒng)攝作用,血液才可循行脈中,若 氣虛無法統(tǒng)攝,血溢脈外,則會出現(xiàn)各類出血。
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