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酒精性肝損傷大鼠的保護(hù)作用分析(恒溫震蕩儀

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-12-16 09:09【

人胳帶間充質(zhì)干 細(xì)胞( umb i li cal co rd mese nc h? ymal s t e m c el l s , U C MSCs ) 數(shù)量豐 富 , 在組織 工程 和 細(xì)胞 治療領(lǐng) 域具有很大 的應(yīng)用 價(jià)值 。 近年來 , 研 究發(fā)現(xiàn)人 UCM SC s 具有 免疫調(diào)節(jié) 和 分化為 肝細(xì) 胞 的 能力 , 在治療肝臟疾病方面有 顯著 的 療效。


1 材料與方法 


1 . 1 動(dòng)物 、 試劑 、 藥物與儀器


40 只 健康 S D 大 鼠 , 體 質(zhì)量為 ( 1 1 0 ± 2 0 ) g , 雌雄 各半 , 購 自 北京維通 利 華 實(shí) 驗(yàn) 技 術(shù) 有 限 公 司 【 許 可 證 號(hào) S CXK ( 京 ) 2 0 1 1 -00 1 1 】 。 II 型膠原酶( Si gma , 美 國 ) ; D - Ha nk ’ s 液 、 胎 牛 血清 、 DME M/F 1 2 培養(yǎng)基 、 0 . 25 %胰蛋 白 酶 、 Mes e n PRO R STMMe di um ( Gi bi c o , 美 國 ) ; 市 售 5 6 ? 紅星二鍋頭 ; 檢測(cè)血清丙氨 酸氨基轉(zhuǎn)移酶( ALT ) 、 天 門 冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ( AST ) 、 丙二酸( MDA ) 、 超氧化 物歧化酶 ( SO D ) 、 谷胱 甘肽過 氧化物酶 ( GPx ) 試劑 盒( 南京建成 生物 工程研究所 ) ; 蘇木精 - 伊紅染色 液( 北京索萊寶) ; Trans Sc r ip t On e - St ep c D NA 合成 試劑盒和 Tap PC R Mix ( 北 京全式金生 物技術(shù)有限 公司 ) ; CYP2B 1 引 物設(shè)計(jì)及合成 ( 金斯瑞生物科技 公司 ) 。 GL 為本實(shí)驗(yàn)室 自 制 d 光學(xué)顯微鏡( Ol y mpus , 日 本 ) ; 低溫 高 速離心 機(jī)( Thermo , 美 國 ) ; PC R 分析 儀 ( AB I , 美 國 ) ; 酶標(biāo)儀 ( B i o T ek , 美 國 ) ; 恒 溫震蕩 儀( 其林貝爾儀器設(shè)備有 限公司 ) ; 6 孔板 、 培養(yǎng)瓶 、 培養(yǎng)皿( Co min g , 美 國 ) 。 


1 . 2 U C MSC s 培養(yǎng)


經(jīng)醫(yī)院 醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì) 批準(zhǔn)。 經(jīng)過產(chǎn)婦知 情同 意后 , 采集正常 足 月 剖宮產(chǎn) 健康胎兒臍帶組織 , 置人 Ha nk ’ s 液 , 4 尤保存 。 在 超凈 臺(tái) 內(nèi) 取 出 胳帶 , 用 PB S 沖洗血液 , 用 手術(shù) 刀剔 除胳 帶 內(nèi)血管 , 將臍帶剪成 1  ̄ 2 _3 組織塊 , 放 人培養(yǎng)瓶 , 加人 I I 型 膠原酶消 化 , 過濾 、 收集 細(xì)胞 , 接種在 6 孔板內(nèi) , 置于 C 02 培養(yǎng)箱 內(nèi) 培 養(yǎng)。 96 h 后半量更 換培養(yǎng)液 , 以 后 隔 半天半量換 液 , 顯微鏡 下 觀察 , 大約 1 0 d 后 , 細(xì) 胞融合達(dá)到 8 0 %時(shí) , 進(jìn)行 傳 代培 養(yǎng)。


 1 . 3 慢性 ALD 動(dòng) 物模型 的 建 立與 細(xì)胞移植 


干預(yù) n 取 4 0 只 SD 大 鼠 , 正常詞養(yǎng) 1 w , 給予其 中 30 只 白 酒 1 0 ml ’ kg - 1 灌 胃 , 早 晚各一 次 , 連續(xù) 3 0 d 。 待大 鼠狀態(tài) 變差 , 活 動(dòng)減少 , 精神 萎靡 , 毛 發(fā)無光 澤時(shí) , 即 建立慢性 ALD 模型成功 。 將 ALD 動(dòng)物 隨機(jī)分 為 模型 組 ( B 組 ) 、 臍帶 間 充質(zhì)干 細(xì)胞移 植組( C 組 ) 和 臍帶間 充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合甘草酸處理組( D 組 ) 。 給予 B 組動(dòng)物生 理鹽水 〗 ml , 給予 C 組 動(dòng)物 U CMS Cs ( 1 x l O Dl ml , 給 予 D 組 動(dòng) 物 UC MSC s ( l x 1 0 W /L ) 和 甘草酸( 1 00 mg ‘ kg _ l ) l ml , 門靜脈注射 , 另 1 0 只 為對(duì)照 組( A 組 ) , 給予生理鹽水 1 m l 門 靜脈 注射。 1 . 4 血清檢測(cè) 在細(xì) 胞移植 2 w 后 , 經(jīng)尾靜脈取血 , 4X; 、 4 000 r/m 離心 1 0 mi n , 分離 血清 , 于 - 20 T: 冰 箱保存 , 備測(cè)。 


1 . 5 肝組織病理學(xué)檢查


 取血后 , 即 刻取出 肝臟 , 取 部分肝組織用 1 0 %甲 醛 固定 , 常規(guī)石蠟包埋 切片 , HE 染色 , 光學(xué)顯微鏡下觀察 。 


1 . 6 肝組織細(xì) 


胞色素 P45 0 亞 酶 ( CY P2 B 1 ) mRNA 水 平檢測(cè) 采用 RT -PCR 法 , 在液 氮 中 研磨 肝組 織 , 加 人 Tri zd 溶液提取 總 RN A 。 應(yīng)用核酸蛋 白 儀 和瓊脂糖 電泳對(duì)提取 的 RNA 進(jìn)行分析。 取 總 RNA 4 } ^, 8 2 1 水浴 5 以11 , 加 人反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)液 , 44 £ £ 孵 育 60 mi n , 留 取產(chǎn)物待用 。擴(kuò)增參數(shù) , 9 5 1 1 0 mi n , 6 0 T; 5 0 s , 72 T: 延伸 50 s , 7 2 T: 延 伸 1 0 m i n J O T 保存 。 基 因 水平分析采 用 2 - m 法 , 將 GAPDH 設(shè) 為 內(nèi) 參 , 取 C t 值 。 計(jì)算公式為 : A Ct = Ct ( 目 的基 因 ) - Ct ( GA PDH ) ; A A Ct = A Ct ( 實(shí) 驗(yàn)組 ) - 么 0 ( 對(duì)照組 ) 。


2 結(jié)果


2 . 1 肝組織病 


理學(xué)變化 A 組 大 鼠 肝組織結(jié) 構(gòu)完整 , 肝 小葉結(jié) 構(gòu) 清晰 , 細(xì)胞形態(tài)規(guī)則 , 細(xì)胞 核 圓 形 , 胞 質(zhì)豐滿 , 無異常改 變( 圖 1 A ) ; B 組 大鼠肝小 葉 界 限 不清 晰 , 肝細(xì) 胞索排列紊亂 , 細(xì) 胞核模糊 不清 , 肝 細(xì)胞胞質(zhì) 內(nèi) 有大小不等的 圓 形脂骯空泡 , 部分肝細(xì) 胞 腫脹, 可 見點(diǎn) 灶壞死 和 部分炎性 細(xì) 胞 浸潤 ( 圖1 B ) ; C 組和 D 組肝損 傷有不同 程 度 的 減輕 , 以 D 組 減輕較明 顯( 圖 1 C 、 圖 1 D ) 。


2. 2 UCMS Cs 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果


 體 外培 養(yǎng)細(xì) 胞 3  ̄ 5 h , 細(xì) 胞開始貼壁 , 4 8 h 完 全貼壁 , 出 現(xiàn) 長梭形 和少 量成纖維樣細(xì) 胞。 隨著 傳代次數(shù) 的增加 , 成纖維樣的 U C M SC s 增殖 速度加 快 , 擴(kuò) 增純化后 的 第 3 代臍帶 間 充質(zhì)干 細(xì)胞形態(tài)似長梭形 , 呈輻射狀生長( 圖 2 ) 。


2 . 3 各組大 鼠 血清指標(biāo)水平


 比 較 與 A 組 比 , B 組大鼠 血清 A ST 、 ALT 和 M D A 水平顯 著升高 , 而 S O D 和 GPx 水 平顯著降低 ; 與 B 組 比 , C 組和 D 組血清 AST 、 A LT 和 M DA 水 平顯著下降 ( f < 0. 05 ) , SO D 和 GPx 水平顯著 升高  。


3 討論 


研究指 出 , 酒精 中 的 乙 醇在代謝時(shí)產(chǎn)生大量 的 自 由 基 , 致使肝細(xì) 胞膜 發(fā)生 脂質(zhì)過 氧化 , 能引 起 肝 臟組織 中 的肝細(xì) 胞損 傷和 死亡 , 導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶升高 。酒精 代謝過程 中 產(chǎn)生 的 乙 醛會(huì)對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生 毒性 作用 , 抑制 谷胱; 甘 肽( g l u t at h i o ne , GSH ) 的合成 , 減弱 SO D 等抗 氧化能力 , 導(dǎo)致大量 MD A 等 氧化物 的 生 成i 8 \ M D A 的含量可 以 反映 出 機(jī)體細(xì)胞 受 自 由 基攻 擊 的 程 度 , S O D 、 GS H 的 活 性 高 低是 反 映 機(jī)體抗 氧 化能 力 的指標(biāo)M。 A TL 和 A ST 存 在 于 肝細(xì)胞漿 中 , 當(dāng) 肝細(xì) 胞受損 時(shí) , 可使血 清 A TL 和 A ST 水平升 高 ,是肝損 傷 的敏感指標(biāo) 。






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