乳酸菌作為一種重要的腸道微生物菌群在動物 胃腸道內(nèi)發(fā)揮重要作用。大量研究顯示,乳酸菌在腸 道內(nèi)發(fā)酵過程中能產(chǎn)生大量乳酸、乙酸及其他揮發(fā)性 脂肪酸,從而調(diào)控動物胃腸道內(nèi)的 pH 值,以提高鐵、 磷、鈣等多種微量元素的吸收和利用。除此之外, 乳酸菌可利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生大量有機酸,對維持動物 胃腸道內(nèi)的微生物區(qū)系平衡和保護動物消化機能具 有不容忽視的作用; 動物胃腸道內(nèi)的乳酸菌群可對多 種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌產(chǎn)生明顯的抑制作 用,并激活巨噬細胞、NK 細胞和 B 淋巴細胞,從而增 強機體的免疫功能。
1 材料
1. 1 樣品
成年牛瘤胃,由黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學與
技術學院提供。
1. 2 主要試劑
MRS 固體/液體培養(yǎng)基,購自北京奧博星生物技
術有限責任公司; 乳酸菌生化鑒定管,購自青島高科
技工業(yè)園海博生物科技有限公司。
1. 3 主要儀器
潔凈工作臺( 型號為 BCN-1360B) ,購自哈爾濱
市東聯(lián)電子技術有限公司; 恒溫搖床( 型號為 BSD-
YX3600) ,購自上海旻泉儀器有限公司; 電子精密天
平( 型號為 JA2003N) ,購自上海佑科儀器儀表有限
公司; 臺式離心機( 型號為 TDL-5-A) ,購自上海飛
鴿儀器有限公司; 生物顯微鏡( 型號為 DM2500) ,購
自北京悅昌行科技有限公司; 電熱恒溫培養(yǎng)箱( 型號為 DRP-9082) ,購自上海森信實驗儀器有限公司; 超
低溫 冰 箱[型 號 為 MDF - 382E ( N) ],購 自 日 本
Hitachi 公司; 電熱恒溫水浴鍋( 型號為 HWS12) ,購
自上海一恒科學儀器有限公司; 旋渦振蕩器( 型號為 其林貝爾QL-861) ,購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司;
精密 pH 計( 型號為 PHS - 3C) ,購自上海雷磁儀器
廠; 多 功 能 酶 標 儀 ( 型 號 為 TECAN Infinite
M200PRO) ,購自瑞士 Tecan 公司。
2 方法
2. 1 菌株的分離純化與形態(tài)觀察
從瘤胃內(nèi)層取樣,將樣品剪碎置無菌生理鹽水中,
離心獲取上清液。按照 1 ∶ 100 比例稀釋上清液,均勻
涂布于 MRS 固體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng) 24 h,挑取
生長狀態(tài)良好的單個菌落,反復劃線分離至獲得純菌
株,將其命名為 Y-A-2。觀察菌落形態(tài),并且進行革
蘭氏染色,使用生物顯微鏡觀察細菌形態(tài)及顏色。
2. 2 生化試驗
采用直接接種法。從 MRS 固體培養(yǎng)基中挑取已
純化培養(yǎng)的 Y-A-2 菌株接種于生化鑒定管中,用封
口膜封口。除 1%馬尿酸鈉的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間
為 37 ℃ 水浴 2 h 外,其他試劑七葉苷、纖維二糖、麥
芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳
糖均為 37 ℃培養(yǎng) 24 ~ 48 h。根據(jù)生化鑒定管的顏色
變化來判斷乳酸菌的發(fā)酵情況: 七葉苷,陽性為黃色或
黑色,陰性為紫色或紫灰色; 纖維二糖、麥芽糖、甘露
醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳糖,陽性為
黃色,陰性為紫色或紫灰色; 1%馬尿酸鈉,陽性為深
紫色,陰性為淡紫色或無色。
2. 3 16S rRNA 序列比對與分析
在形態(tài)分析和生化試驗基礎上,委托吉林省庫美
生物科技有限公司合成乳酸菌通用引物,序列為 27F
5' - AGAGTTTGATCMTGGCTCAG - 3' 和 1492R 5' -
TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3',挑取已純化培養(yǎng)
的 Y-A-2 菌株接種于 MRS 液體培養(yǎng)基中進行擴增,
委托吉林省庫美生物科技有限公司對其進行 16S
rRNA 序列檢測,將所得測序結果輸入 GenBank 中對
其進行同源性比對分析。
2. 4 生物學特性研究
2. 4. 1 最適溫度的測定
在 MRS 液體培養(yǎng)基和振
蕩速度相同的情況下,挑取 Y-A- 2 純菌株接種到
7 支試管中,然后分別于 16,23,30,37,44,51,58 ℃
溫度條件下?lián)u床培養(yǎng) 24 h,測定其 OD600值并記錄,重
復 3 次。從 7 個溫度中選取最優(yōu)溫度采用二分法
[( X±7) ,( X±3) ,( X±1) ℃,]進行再次測量,直至得
到最適溫度并記錄,重復 3 次。
2. 4. 2 生長曲線的繪制
挑取 Y-A-2 純菌株接種
到試管中,在最適溫度條件下,24 h 內(nèi)每隔 2 h 測定
該菌的 OD600值 1 次并記錄,重復 3 次。2. 4. 3 pH 值的測定 挑取 Y-A-2 純菌株接種到試
管中,在最適溫度條件下,24 h 內(nèi)每隔 2 h 測定該菌
的 pH 值 1 次并記錄,重復 3 次。
2. 4. 4 耐鹽性試驗將 MRS 液體培養(yǎng)基中的鹽濃
度分 別 調(diào) 節(jié) 至 1. 5%、3. 5%、5. 5%、7. 5%、9. 5%、
11. 5%,每支試管分裝 3 mL,每管接種菌液 120 μL,
37 ℃厭氧培養(yǎng) 24 h,記錄 OD600值,重復 3 次。
2. 4. 5 耐酸堿試驗 將 MRS 液體培養(yǎng)基的 pH 值調(diào)
節(jié) 至 1. 5,3. 5,5. 5,7. 5,9. 5,11. 5,每 支 試 管 分 裝
3 mL,每管接種菌液 120 μL,37 ℃ 厭氧培養(yǎng) 24 h,記
錄 OD600值,重復 3 次。
3 結果與分析
用接種針從 MRS 固體培養(yǎng)基上挑取已純化培養(yǎng) 的同一菌落接種于生化鑒定管中,置( 36 ± 1) ℃ 溫箱 中恒溫培養(yǎng) 36 h 后對比顏色得出結果。從糖發(fā)酵試 驗中得知,該菌株可以發(fā)酵纖維二糖、水楊苷、菊糖。 生化試驗結果。厭氧培養(yǎng) 24 h 后可見菌落分散,菌落呈圓形,中 等大小,凸起,濕潤,邊緣整齊,直徑為( 3± 1) mm,菌 落正面為乳白色,背面為黃色。多 次重復劃線分離純化菌株,對純化后的菌株進行革蘭 氏染色,可見該菌株為革蘭氏陽性、菌體單獨排列或 以小群聚集生長,菌體呈球狀。初 步判定此菌株為革蘭氏陽性球菌。
4 結論
本試驗從牛瘤胃中分離純化出 Y-A-2 菌株,對
該菌進行菌落形態(tài)觀察、生化試驗和 16S rRNA 序列
同源性分析鑒定,確定 Y-A-2 菌株為乳酸片球菌。
生物學特性研究結果顯示,Y-A-2 菌株的最適生長
溫度為 26 ℃,相比于其他同種菌株,24 h 內(nèi)生長較為
緩慢,具有一定的耐鹽能力,不耐強酸強堿。
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